2种测定神经生长因子活性方法的比较研究*
作者：徐天瑞 董跃伟 熊郁良
单位：董跃伟(云南省药品检验所)；徐天瑞 熊郁良(中国科学院昆明动物研究所 昆明 660223)
关键词：神经生长因子；PC12细胞；神经节；活性测定
药物分析杂志000106 摘 要：目的：比较2种测定神经生长因子活性的最常用方法，对活性测定条件进行了部分改进。方法：鸡胚背根神经节组织培养法，PC12细胞培养法。结果：鸡胚背根神经节培养法灵敏度为50 μg.L-1。PC12细胞用于定性测定灵敏度为20 μg.L-1。PC12细胞用于定量测定灵敏度可达1 μg.L-1。结论：鸡胚背根神经节培养法实验条件要求简单，易于开展，但操作复杂，干扰因素多，一般用于定性测定。PC12细胞培养法操作简单，干扰因素少，实验结果客观，但实验条件要求高，需要有可靠的细胞株和完备的细胞培养设备。
, http://www.100md.com
The Comparative Studies of Two Bioassay Methods of Nerve Growth Factor
Xu Tianrui Dong Yuewei Xiong Yuliang
(Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223)
Abstract：Objective：The most common two NGF bioassay methods were studied, some culture conditions were also improved. Method:Chicken embryo dorsal ganglion culture and PC12 cell culture.Results:The sensitivity of chicken embryo ganglia culture was 50 μg.L-1, the sensitivity of PC12 cell culture in qualitative assay was 20 μg.L-1, the sensitivity of PC12 cell culture in quantitative assay could reach 1μg.L-1. Conclusion:The bioassay of chicken ganglion required only simple experimental conditions, but the manipulation was rather difficult, and the bioassay results were affected by a lot of uncertain factors, so chicken embryo ganglion culture could only be used in qualitative assay. PC12 cell culture required perfect cell culture conditions and reliable PC12 cell clone, while the manipulation of PC12 cell culture was rather easy and few factors could interfere with the objectivity of bioassay results. This bioassay could be used both in qualitative and quantitative assays.
, 百拇医药
Key words：nerve growth factor, PC12 cells, ganglion, bioassay▲
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种对多种细胞，特别是神经细胞的生长、发育、分化和新陈代谢等方面有重要调控作用的生物活性多肽[1,2]，目前已被用于神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗中。NGF的研究极大地推动了神经生物学和细胞生物学的发展，蛇毒和小鼠颌下腺是NGF最丰富的来源[2～4]。活性测定是结构和功能研究的基础。目前，国际上用于NGF活性测定的方法主要有2种，即：鸡胚背根神经节培养法和PC12细胞(Pheochromocytoma cells，大鼠肾上腺嗜铬细胞)培养法。鸡胚背根神经元节培养法最早由Levi-Montalcini等人于1954年开始使用[1]，NGF促使离体的背根神经节长出放射状的神经纤维。该方法特异性较高，实验条件要求简单，成了NGF活性检测中最为经典的方法。1975年Tischler等人在用PC12细胞研究NGF受体过程中,意外发现了NGF可使PC12细胞停止分裂,长出突起,转化成神经元样细胞[5]。这一发现导致了PC12细胞培养测定法的产生。由于PC12细胞是一个可连续传代的瘤细胞,均一性好,克服了神经节的不均一性，近年来国外用此法进行NGF活性测定的报道已越来越多，有逐步取代鸡胚背根神经节培养法的趋势[6～8]。
, 百拇医药
国内外关于2种测定方法的比较研究作者尝未见报道，本实验结合我国国情，对2种测定方法进行了比较研究，并对活性测定条件的改进进行了有益的探索。
1 材料和方法
1.1 材料 受精鸡蛋：AA肉鸡鸡蛋和罗曼蛋鸡鸡蛋购自昆明市实验鸡场，盐津乌骨鸡蛋购自昆明动物研究所饲养场。PC12细胞：引自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库(KCB93033YJ)。神经生长因子：从中华眼镜蛇毒(Naia naja atra)分离纯化获得，电泳纯度一条带，HPLC单峰。RPMI 1640：日本 日水制药株式会社。马血清：美国生命技术公司，批号1009853。小牛血清：杭州四季清生物制品厂。鼠尾胶原、雄鸡血浆和鸡胚浸液：自备。
1.2 方法
1.2.1 鸡胚背根神经节培养法 在无菌状态下剥离孵化8 d的鸡胚背根神经节，植于涂布了胶原的96孔培养板的小孔中，每孔2～3个神经节，CO2培养箱中37 ℃培养30 h。培养基为50 μL鸡血浆，25 μL鸡胚浸液，50 μL RPMI 1640，25 μL待测样品。有活性的样品可促使神经纤维从神经节上放射状长出。
, 百拇医药
1.2.2 PC12细胞培养法 A 定性测定。取适量生长良好PC12细胞，接种于盛有10 mL的定性测定培养液(85% RPMI 1640，15% 小牛血清)的培养瓶中，分别加入样品或对照的生理盐水，37 ℃培养，每3～4 d换1次培养液，10 d后对照组的细胞仍呈球形，有活性的实验组PC12细胞分化出神经样的突触。B 定量测定。致敏PC12细胞的制备：见Green等(1983)[6]。取致敏细胞适量，接种于有10 mL定量测定培养液(85% RPMI 1640，12% 小牛血清，3% 热灭活马血清)的培养瓶中，加入不同浓度的样品或生理盐水，37 ℃培养24 h，于显微镜下观察，随机计数10个视野，每个视野统计10个细胞团，明显长出突触的细胞团记为活性细胞团。根据定义(1 mL活性测定培养液中，促进产生50%活性细胞团的NGF量定义为1个活性单位)算出活性单位数。
2 结果
2.1 鸡胚背根神经节培养法 如图1-A～1D。
, 百拇医药
图1 神经生长因子对鸡胚背根神经节及PC12细胞的影响
A，B-培养30 h后的乌骨鸡胚神经节，标尺=100 μm
A：对照组，少量短粗的神经纤维从神经节长出
B：NGF组，大量神经纤维从神经节放射状长出
C，D-培养30 h后的AA鸡胚神经节，标尺=100 μm
C：对照组，在神经节的一定部位有长而稀的神经纤维长出
D：NGF组，短而致密的神经纤维从神经节四周放射状长出
E，F-定性测定培养液中的PC12细胞，标尺=25 μm
E：对照组，细胞呈圆球形
, 百拇医药
F：NGF组，大量PC12细胞分化成神经元样细胞
G，H-PC12细胞定量测定，标尺 = 50 μm
G：对照组，细胞团大都无神经样纤维长出
H：NGF组，细胞团长出大量神经样纤维
目前，国内外所采用的测定法，多为较原始的悬滴培养法，我们改用96孔板后得到了满意的结果。
培养30 h的乌骨鸡胚背根神经节，对照组仅有少量短粗的神经纤维从神经节长出(图1-A) ，实验组(50 μg.L-1 NGF)有大量神经纤维从神经节放射状长出(图1-B)。
培养30 h的AA肉鸡鸡胚背根神经节，对照组和实验组(50 μg.L-1 NGF)均有神经纤维从神经节长出，但实验组较为短密(图1-C)，对照组较为长稀(图1-D)。罗曼蛋鸡的背根神经节培养情况与AA肉鸡类似。
, 百拇医药
2.2 PC12细胞培养法 如图1-E～H。
在国外文献报道的基础上,我们对PC12细胞培养法进行了部分改进，初步总结出了2种实用的分别用于定性和定量的培养方法。
定性测定法：在定性测定培养液中培养了10 d的PC12细胞, 对照组细胞呈圆球形(图1-E)，有大量的实验组(20 μg.L-1 NGF)细胞长出神经状纤维(图1-F)。
定量测定法：致敏后的PC12细胞接种于定量测定培养液中培养24 h后，对照组细胞聚集成小团，大多无神经状纤维长出(图1-G)，实验组(5 μg.L-1 NGF)细胞聚集成团并长出神经状纤维(图1-H)。测定灵敏度最高可达1 μg.L-1。
表1比较了鸡胚背根神经节培养法和PC12细胞培养法的优缺点。
, 百拇医药
表1 鸡胚神经节培养法和PC12细胞培养法比较
PC12细胞培养法
鸡胚神经节培养法
定性
定量
操作
简单
简单
复杂
干扰因素
少
少
多
, http://www.100md.com
客观性
好
较好
差
灵敏度
较低
高
低
实验条件要求
较高
较高
低
3 讨论
3.1 鸡胚背根神经节法在实验条件要求不高的情况下可对NGF进行定性，该法不需特殊的PC12细胞，可免去细胞复苏、传代及细胞冻存等细胞培养和日常保管维护过程中所需的设备和专门技术，因而多年来在国内广为使用。在提取制备的中间步骤和初步测定NGF活性时这种方法有它的优越之处，但由于背根神经节剥离困难，需自备鸡血浆、鸡胚浸液和鼠尾胶原，容易污染，不确定因素多，造成实验条件不一，重现性差。该测定法以NGF刺激神经节长出神经纤维的致密度、长短和挺直程度为活性大小的判定标准，人为因素很大，难以进行定量测定。对于眼镜蛇毒NGF需50 μg.L-1的浓度才能在培养的神经节上有明显反应。
, 百拇医药
国内外常用的鸡胚神经节悬滴培养法[1～4]虽然拍照方便，但在悬滴培养板上，培养基及样品均不易混合均匀，容易造成假象，且各培养板之间的培养条件也难以一致。经过摸索，我们发现用96孔克隆培养板可克服上述问题，在96孔板中培养基及样品均可混合均匀，各孔之间培养条件相对一致，而且可以连续观察，一次可测定大量的样品。如需拍照可在小孔中加入固定液，待培养基凝固后整块地取出拍照。
在实验过程中我们发现，不同种的鸡胚背根神经节在相同的培养条件下生长状况不一，市售的2种“洋鸡” (AA肉鸡和罗曼蛋鸡)的鸡胚神经节，在无NGF的培养基中也可长出一定数量的神经纤维，只是在加入NGF后，长出的神经纤维更为致密，这种情况十分容易形成假阳性的判断。常见的“土鸡”黑羽乌骨鸡的背根神经节，在无NGF的培养基中只有极少量的小突起从神经节长出，不会对活性判断形成干扰，十分有利于活性测定。因此，我们认为鸡种的选择非常重要。形成这种差别的原因还不清楚，这是否与“洋鸡”在选育过程中改变了对血清因子敏感程度有关还有待进一步研究。
, 百拇医药
3.2 PC12细胞培养法操作简单，只需常规的细胞培养和传代手段，干扰因素少，活性判断标准客观，既可用于定性分析又可用于定量分析，是一种较为理想的测定法，但不同的PC12细胞亚系有不同的生物学特性，对NGF的敏感性也不同。因此，得到合适的PC12细胞亚系是活性检测的关键[9]。
国外用PC12细胞测定神经生长因子活性时，多采用10%的马血清+5%的小牛血清+85%的1640作为培养液，并在涂布了胶原的培养皿中进行[5～8]。我们发现在这种培养液中PC12细胞极易聚团，聚团的程度随马血清比例的升高而升高。在涂布了胶原后，检测的背景增高，易污染。于是，我们降低了马血清在培养基中的浓度，经过摸索找到了2种用于测定神经生长因子活性的方法即定量、定性测定法。在定量测定中，我们采用12%的小牛血清+3%的马血清+85%的1640，在这种培养条件下，PC12细胞不易聚团，突触生长良好，且可在不涂布胶原的培养瓶中进行。因此，这种方法背景低，在传代时只需振荡培养瓶即可使PC12细胞脱离培养瓶，十分有利于定量检测。
, http://www.100md.com
在15%的小牛血清+85%的1640培养基中，PC12细胞可以生存，但生长状态不佳，细胞呈圆球形，而加入神经生长因子后，PC12细胞可以正常生长并分化出神经元样的突触。因此，我们采用这种无马血清的培养基作为定性培养基，它可以十分清晰地区分有活性的样品和无活性的样品，克服判断上的人为因素。这种方法虽然灵敏度不高，但结果可靠，完全可以用于一般的生物学分析和药检。■
*本论文受云南省重点基金“蛇毒NGF治疗男性不育研究”的资助，项目编号980468
参考文献：
[1]Levi-Montalcini R, Meyer H, Hamburger V. In vitro experiments on the effects of mouse Sarcomas 180 and 37 on the spinal and sympathetic ganglia of the chick embryo. Cancer Res, 1954, 14(1): 49
, http://www.100md.com
[2]Thoenen H, Barde Y A. Physiology of nerve growth factor. Physiol Rev, 1980, 60(4): 1284
[3]雷少波，吴秀荣.中华眼镜蛇毒神经生长因子的分离纯化及监定.生物化学与生物物理学报，1989, 21(2): 115
[4]Koyama J, Inoue S, Ikeda K, et al. Purification and amino-acid sequence of a nerve growth factor from the venom of Vipera russelli. Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1160(2): 287
[5]Tischler A S, Green L A. Nerve growth factor-induced process formation by cultured rat pheochromocytoma cells. Nature, 1975, 258(5333): 341
, 百拇医药
[6]Rukenstein A, Greene L A. The quantitative bioassay of nerve growth factor use of frozen ‘primed' pc12 pheochromocytoma cells. Brain Res, 1983, 263(1): 177
[7]Shaughnessy L W, Barone S Jr. Damage to the NBM leads to a sustained lesion-induced increase in functional NGF in the cortex. Neuroreport, 1997, 8(12): 2767
[8]Woo S B, Timm D E, Neet K E. Alteration of NH2-terminal residues of nerve growth factor affects activity and Trk binding without affecting stability or conformation. J Biol Chem, 1995, 270 (11): 6278
[9]Sano M, Kato K, Totsuka T, et al. A convenient bioassay for NGF using a new subline of PC12 pheochromocytoma cells (PC12D). Brain Res, 1988, 459: 404
收稿日期：1999-01-27, 百拇医药
单位：董跃伟(云南省药品检验所)；徐天瑞 熊郁良(中国科学院昆明动物研究所 昆明 660223)
关键词：神经生长因子；PC12细胞；神经节；活性测定
药物分析杂志000106 摘 要：目的：比较2种测定神经生长因子活性的最常用方法，对活性测定条件进行了部分改进。方法：鸡胚背根神经节组织培养法，PC12细胞培养法。结果：鸡胚背根神经节培养法灵敏度为50 μg.L-1。PC12细胞用于定性测定灵敏度为20 μg.L-1。PC12细胞用于定量测定灵敏度可达1 μg.L-1。结论：鸡胚背根神经节培养法实验条件要求简单，易于开展，但操作复杂，干扰因素多，一般用于定性测定。PC12细胞培养法操作简单，干扰因素少，实验结果客观，但实验条件要求高，需要有可靠的细胞株和完备的细胞培养设备。
, http://www.100md.com
The Comparative Studies of Two Bioassay Methods of Nerve Growth Factor
Xu Tianrui Dong Yuewei Xiong Yuliang
(Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223)
Abstract：Objective：The most common two NGF bioassay methods were studied, some culture conditions were also improved. Method:Chicken embryo dorsal ganglion culture and PC12 cell culture.Results:The sensitivity of chicken embryo ganglia culture was 50 μg.L-1, the sensitivity of PC12 cell culture in qualitative assay was 20 μg.L-1, the sensitivity of PC12 cell culture in quantitative assay could reach 1μg.L-1. Conclusion:The bioassay of chicken ganglion required only simple experimental conditions, but the manipulation was rather difficult, and the bioassay results were affected by a lot of uncertain factors, so chicken embryo ganglion culture could only be used in qualitative assay. PC12 cell culture required perfect cell culture conditions and reliable PC12 cell clone, while the manipulation of PC12 cell culture was rather easy and few factors could interfere with the objectivity of bioassay results. This bioassay could be used both in qualitative and quantitative assays.
, 百拇医药
Key words：nerve growth factor, PC12 cells, ganglion, bioassay▲
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种对多种细胞，特别是神经细胞的生长、发育、分化和新陈代谢等方面有重要调控作用的生物活性多肽[1,2]，目前已被用于神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗中。NGF的研究极大地推动了神经生物学和细胞生物学的发展，蛇毒和小鼠颌下腺是NGF最丰富的来源[2～4]。活性测定是结构和功能研究的基础。目前，国际上用于NGF活性测定的方法主要有2种，即：鸡胚背根神经节培养法和PC12细胞(Pheochromocytoma cells，大鼠肾上腺嗜铬细胞)培养法。鸡胚背根神经元节培养法最早由Levi-Montalcini等人于1954年开始使用[1]，NGF促使离体的背根神经节长出放射状的神经纤维。该方法特异性较高，实验条件要求简单，成了NGF活性检测中最为经典的方法。1975年Tischler等人在用PC12细胞研究NGF受体过程中,意外发现了NGF可使PC12细胞停止分裂,长出突起,转化成神经元样细胞[5]。这一发现导致了PC12细胞培养测定法的产生。由于PC12细胞是一个可连续传代的瘤细胞,均一性好,克服了神经节的不均一性，近年来国外用此法进行NGF活性测定的报道已越来越多，有逐步取代鸡胚背根神经节培养法的趋势[6～8]。
, 百拇医药
国内外关于2种测定方法的比较研究作者尝未见报道，本实验结合我国国情，对2种测定方法进行了比较研究，并对活性测定条件的改进进行了有益的探索。
1 材料和方法
1.1 材料 受精鸡蛋：AA肉鸡鸡蛋和罗曼蛋鸡鸡蛋购自昆明市实验鸡场，盐津乌骨鸡蛋购自昆明动物研究所饲养场。PC12细胞：引自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库(KCB93033YJ)。神经生长因子：从中华眼镜蛇毒(Naia naja atra)分离纯化获得，电泳纯度一条带，HPLC单峰。RPMI 1640：日本 日水制药株式会社。马血清：美国生命技术公司，批号1009853。小牛血清：杭州四季清生物制品厂。鼠尾胶原、雄鸡血浆和鸡胚浸液：自备。
1.2 方法
1.2.1 鸡胚背根神经节培养法 在无菌状态下剥离孵化8 d的鸡胚背根神经节，植于涂布了胶原的96孔培养板的小孔中，每孔2～3个神经节，CO2培养箱中37 ℃培养30 h。培养基为50 μL鸡血浆，25 μL鸡胚浸液，50 μL RPMI 1640，25 μL待测样品。有活性的样品可促使神经纤维从神经节上放射状长出。
, 百拇医药
1.2.2 PC12细胞培养法 A 定性测定。取适量生长良好PC12细胞，接种于盛有10 mL的定性测定培养液(85% RPMI 1640，15% 小牛血清)的培养瓶中，分别加入样品或对照的生理盐水，37 ℃培养，每3～4 d换1次培养液，10 d后对照组的细胞仍呈球形，有活性的实验组PC12细胞分化出神经样的突触。B 定量测定。致敏PC12细胞的制备：见Green等(1983)[6]。取致敏细胞适量，接种于有10 mL定量测定培养液(85% RPMI 1640，12% 小牛血清，3% 热灭活马血清)的培养瓶中，加入不同浓度的样品或生理盐水，37 ℃培养24 h，于显微镜下观察，随机计数10个视野，每个视野统计10个细胞团，明显长出突触的细胞团记为活性细胞团。根据定义(1 mL活性测定培养液中，促进产生50%活性细胞团的NGF量定义为1个活性单位)算出活性单位数。
2 结果
2.1 鸡胚背根神经节培养法 如图1-A～1D。
, 百拇医药
图1 神经生长因子对鸡胚背根神经节及PC12细胞的影响
A，B-培养30 h后的乌骨鸡胚神经节，标尺=100 μm
A：对照组，少量短粗的神经纤维从神经节长出
B：NGF组，大量神经纤维从神经节放射状长出
C，D-培养30 h后的AA鸡胚神经节，标尺=100 μm
C：对照组，在神经节的一定部位有长而稀的神经纤维长出
D：NGF组，短而致密的神经纤维从神经节四周放射状长出
E，F-定性测定培养液中的PC12细胞，标尺=25 μm
E：对照组，细胞呈圆球形
, 百拇医药
F：NGF组，大量PC12细胞分化成神经元样细胞
G，H-PC12细胞定量测定，标尺 = 50 μm
G：对照组，细胞团大都无神经样纤维长出
H：NGF组，细胞团长出大量神经样纤维
目前，国内外所采用的测定法，多为较原始的悬滴培养法，我们改用96孔板后得到了满意的结果。
培养30 h的乌骨鸡胚背根神经节，对照组仅有少量短粗的神经纤维从神经节长出(图1-A) ，实验组(50 μg.L-1 NGF)有大量神经纤维从神经节放射状长出(图1-B)。
培养30 h的AA肉鸡鸡胚背根神经节，对照组和实验组(50 μg.L-1 NGF)均有神经纤维从神经节长出，但实验组较为短密(图1-C)，对照组较为长稀(图1-D)。罗曼蛋鸡的背根神经节培养情况与AA肉鸡类似。
, 百拇医药
2.2 PC12细胞培养法 如图1-E～H。
在国外文献报道的基础上,我们对PC12细胞培养法进行了部分改进，初步总结出了2种实用的分别用于定性和定量的培养方法。
定性测定法：在定性测定培养液中培养了10 d的PC12细胞, 对照组细胞呈圆球形(图1-E)，有大量的实验组(20 μg.L-1 NGF)细胞长出神经状纤维(图1-F)。
定量测定法：致敏后的PC12细胞接种于定量测定培养液中培养24 h后，对照组细胞聚集成小团，大多无神经状纤维长出(图1-G)，实验组(5 μg.L-1 NGF)细胞聚集成团并长出神经状纤维(图1-H)。测定灵敏度最高可达1 μg.L-1。
表1比较了鸡胚背根神经节培养法和PC12细胞培养法的优缺点。
, 百拇医药
表1 鸡胚神经节培养法和PC12细胞培养法比较
PC12细胞培养法
鸡胚神经节培养法
定性
定量
操作
简单
简单
复杂
干扰因素
少
少
多
, http://www.100md.com
客观性
好
较好
差
灵敏度
较低
高
低
实验条件要求
较高
较高
低
3 讨论
3.1 鸡胚背根神经节法在实验条件要求不高的情况下可对NGF进行定性，该法不需特殊的PC12细胞，可免去细胞复苏、传代及细胞冻存等细胞培养和日常保管维护过程中所需的设备和专门技术，因而多年来在国内广为使用。在提取制备的中间步骤和初步测定NGF活性时这种方法有它的优越之处，但由于背根神经节剥离困难，需自备鸡血浆、鸡胚浸液和鼠尾胶原，容易污染，不确定因素多，造成实验条件不一，重现性差。该测定法以NGF刺激神经节长出神经纤维的致密度、长短和挺直程度为活性大小的判定标准，人为因素很大，难以进行定量测定。对于眼镜蛇毒NGF需50 μg.L-1的浓度才能在培养的神经节上有明显反应。
, 百拇医药
国内外常用的鸡胚神经节悬滴培养法[1～4]虽然拍照方便，但在悬滴培养板上，培养基及样品均不易混合均匀，容易造成假象，且各培养板之间的培养条件也难以一致。经过摸索，我们发现用96孔克隆培养板可克服上述问题，在96孔板中培养基及样品均可混合均匀，各孔之间培养条件相对一致，而且可以连续观察，一次可测定大量的样品。如需拍照可在小孔中加入固定液，待培养基凝固后整块地取出拍照。
在实验过程中我们发现，不同种的鸡胚背根神经节在相同的培养条件下生长状况不一，市售的2种“洋鸡” (AA肉鸡和罗曼蛋鸡)的鸡胚神经节，在无NGF的培养基中也可长出一定数量的神经纤维，只是在加入NGF后，长出的神经纤维更为致密，这种情况十分容易形成假阳性的判断。常见的“土鸡”黑羽乌骨鸡的背根神经节，在无NGF的培养基中只有极少量的小突起从神经节长出，不会对活性判断形成干扰，十分有利于活性测定。因此，我们认为鸡种的选择非常重要。形成这种差别的原因还不清楚，这是否与“洋鸡”在选育过程中改变了对血清因子敏感程度有关还有待进一步研究。
, 百拇医药
3.2 PC12细胞培养法操作简单，只需常规的细胞培养和传代手段，干扰因素少，活性判断标准客观，既可用于定性分析又可用于定量分析，是一种较为理想的测定法，但不同的PC12细胞亚系有不同的生物学特性，对NGF的敏感性也不同。因此，得到合适的PC12细胞亚系是活性检测的关键[9]。
国外用PC12细胞测定神经生长因子活性时，多采用10%的马血清+5%的小牛血清+85%的1640作为培养液，并在涂布了胶原的培养皿中进行[5～8]。我们发现在这种培养液中PC12细胞极易聚团，聚团的程度随马血清比例的升高而升高。在涂布了胶原后，检测的背景增高，易污染。于是，我们降低了马血清在培养基中的浓度，经过摸索找到了2种用于测定神经生长因子活性的方法即定量、定性测定法。在定量测定中，我们采用12%的小牛血清+3%的马血清+85%的1640，在这种培养条件下，PC12细胞不易聚团，突触生长良好，且可在不涂布胶原的培养瓶中进行。因此，这种方法背景低，在传代时只需振荡培养瓶即可使PC12细胞脱离培养瓶，十分有利于定量检测。
, http://www.100md.com
在15%的小牛血清+85%的1640培养基中，PC12细胞可以生存，但生长状态不佳，细胞呈圆球形，而加入神经生长因子后，PC12细胞可以正常生长并分化出神经元样的突触。因此，我们采用这种无马血清的培养基作为定性培养基，它可以十分清晰地区分有活性的样品和无活性的样品，克服判断上的人为因素。这种方法虽然灵敏度不高，但结果可靠，完全可以用于一般的生物学分析和药检。■
*本论文受云南省重点基金“蛇毒NGF治疗男性不育研究”的资助，项目编号980468
参考文献：
[1]Levi-Montalcini R, Meyer H, Hamburger V. In vitro experiments on the effects of mouse Sarcomas 180 and 37 on the spinal and sympathetic ganglia of the chick embryo. Cancer Res, 1954, 14(1): 49
, http://www.100md.com
[2]Thoenen H, Barde Y A. Physiology of nerve growth factor. Physiol Rev, 1980, 60(4): 1284
[3]雷少波，吴秀荣.中华眼镜蛇毒神经生长因子的分离纯化及监定.生物化学与生物物理学报，1989, 21(2): 115
[4]Koyama J, Inoue S, Ikeda K, et al. Purification and amino-acid sequence of a nerve growth factor from the venom of Vipera russelli. Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1160(2): 287
[5]Tischler A S, Green L A. Nerve growth factor-induced process formation by cultured rat pheochromocytoma cells. Nature, 1975, 258(5333): 341
, 百拇医药
[6]Rukenstein A, Greene L A. The quantitative bioassay of nerve growth factor use of frozen ‘primed' pc12 pheochromocytoma cells. Brain Res, 1983, 263(1): 177
[7]Shaughnessy L W, Barone S Jr. Damage to the NBM leads to a sustained lesion-induced increase in functional NGF in the cortex. Neuroreport, 1997, 8(12): 2767
[8]Woo S B, Timm D E, Neet K E. Alteration of NH2-terminal residues of nerve growth factor affects activity and Trk binding without affecting stability or conformation. J Biol Chem, 1995, 270 (11): 6278
[9]Sano M, Kato K, Totsuka T, et al. A convenient bioassay for NGF using a new subline of PC12 pheochromocytoma cells (PC12D). Brain Res, 1988, 459: 404
收稿日期：1999-01-27, 百拇医药